液体PTVA：一种在毕赤酵母中生成多拷贝克隆的高效、低成本新方法

01文章背景概述BACKGROUNDINTRODUCTION毕赤酵母常用于传达外源蛋白，是一个理想的细胞工厂，因为它需要超过十分低的细胞密度，并将蛋白质黏液到上清液中，并且毕赤酵母本身黏液的天然蛋白质较较少，修改了下游提纯的工艺。减少同源基因的拷贝数量可以使外源蛋白的产量减少。然而，由于蛋白在黏液途径中不会超过饱和状态，多拷贝克隆和外源蛋白传达两者之间的关系并不是线性的。因此，研究中必须测量具备有所不同拷贝数的菌株，以确认蛋白传达量仅次于的菌株。

因此，必须一种较慢、简单的方法来产生具备一定基因拷贝数的菌株。目前，产生多拷贝克隆的实验方法有几种，还包括转化成前载体的体外多克隆、利用高浓度抗生素必要检验转化成子等。使用必要自由选择法，在所含较高浓度抗生素的平板上产生的菌落数量往往大大减少，从而不会容许取得的多拷贝菌株的数量。

由于必要自由选择法分解多拷贝克隆的效率较低，2008年Sunga等人明确提出了转化成后矢量缩放的方法（PTVA）。在PTVA中，细胞不是在平板上必要用于高浓度的抗生素来检验，而是随着抗生素浓度的减少来展开检验，随着细胞抗生素耐药基因的拷贝数减少，使细胞适应环境更高的抗生素浓度。

PTVA已被普遍应用于毕赤酵母，然而，尽管PTVA较为更容易操作者，但该方法费时费力。2016年2月5日，伦敦帝国学院（ImperialCollegeLondon）的RochelleAw和KarenM．Polizzi等人，在《MicrobialCellFactories》杂志（当前IF4．402；工程技术2区）公开发表了为题“LiquidPTVA：afasterandcheaperalternativeforgeneratingmulti－copyclonesinPichiapastoris”的文章，叙述了一种通过在液体介质中倒数传送来增加PTVA时间和成本的方法，这种方法需要很好的取得包括有所不同拷贝数的菌株。

02所用到的主要方法METHODS1．切换后矢量缩放技术（PTVA）切换后矢量缩放技术（PTVA）是指细胞不是必要通过高浓度的抗生素来展开检验，而是随着抗生素浓度的减少来检验多拷贝的一种方法。在检验的初级阶段，抗生素耐药基因的拷贝数减少，使细胞适应环境更高的抗生素浓度。因此，在较高的抗生素浓度下存活的菌株也所含较高数量目的基因的原始副本。

2．Q－PCR3．分光光度法4．载体建构03文章主要内容摘要ABSTRACT背景：为了提升毕赤酵母重组蛋白传达的产量，研究人员常常用于多个同源基因拷贝克隆的方法。转化成后矢量缩放技术（PTVA）可以有效地在毕赤酵母中分解多拷贝克隆。

然而，尽管这种方法比较更容易操作者、成功率较高，但是这个过程时间周期较为宽，与此同时也不会花费较多的金钱。结果：本文研发了一种改良版的PTVA，称作液体PTVA，这种方法解决了传统PTVA（在液体培养皿检验）的缺点，需要更加慢、更加低廉地自由选择多拷贝克隆。转化成后的细胞是在液体培养基中培育的，只是最后的检验是在琼脂平板上展开的。

这种方法不仅增加了抗生素总体的用于情况，而且提升了克隆扩充的速度。此外，该研究还找到：以单一拷贝的菌株来展开检验可使两种PTVA（传统平板检验和液体检验）产生更高的拷贝数菌株。

另外，在液体PTVA中用于Zeocin作为检验抗生素，可以取得生长速度较高的菌株。

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